1. Allgemeine Fragen
Welche Etiketten sollten verwendet werden?
Für Primärröhrchen sollten kryogene Barcode-Etiketten (31,8 x 31,8 mm, Etiketten für Entnahmeröhrchen) genutzt werden. In den Bestellinformationen für Verbrauchsmaterialien finden Sie weitere Informationen dazu: https://www.bbmri.de/covid-19/nationales-pandemie-kohorten-netz/bioprobensammlung/
Welche Röhrchen müssen mit Etiketten aus dem DZHK-LIMS beklebt werden: die Primärröhrchen oder die Aliquote, die tiefgefroren werden?
Die Primärröhrchen werden mit den Etiketten barcodiert. Die Aliquote sind über den herstellerseitigen 2D-Code eindeutig identifizierbar.
Wie variabel sind die Aliquotvolumina für Blut?
Volumina im Rahmen von 250-500 µl sind in Ordnung, das Gesamtvolumen der Monovette sollte allerdings verwendet und nicht verworfen werden.
Sind abweichende Zentrifugationszeiten wie beispielsweise 2500g/10min/RT zulässig?
Die Zentrifugationszeiten sollten eingehalten werden, um die Standardisierung zu gewährleisten. Wenn dies aus prozesstechnischen Gründen nicht möglich ist, sollte es im DZHK-LIMS dokumentiert werden.
Wie werden Standort-spezifische Abweichungen von den Vorgaben allgemein bewertet?
Die teilnehmenden Standorte müssen gemäß einer Checkliste für Bioproben und -datenerfassung verfahren. Diese Checkliste ist auf der GBN-Website zu finden: https://www.bbmri.de/covid-19/nationales-pandemie-kohorten-netz/bioprobensammlung/
Bestimmte Kriterien sind hierin festgelegt, andere Aspekte verbleiben in der Verantwortung der Standorte. Teilnehmende Standorte müssen die Abweichungen vor Beginn der Probensammlung mit dem Team des Bioprobenkerns besprechen.
Ist es möglich, einen Teil der NAPKON-Proben für lokale Projekte zu nutzen - ohne Minderung der Fallpauschale?
Zwei Drittel der gesammelten Proben sind für NAPKON reserviert, ein Drittel kann für lokale Projekte eingesetzt werden – die Verwendung der lokalen Anteile sollte dem NAPKON-Use & Access-Komitee angezeigt werden.
Sollen bei PatientInnen in der hochauflösenden Kohorte (HAP) tatsächlich über den gesamten Verlauf hinweg (meist vier bis sechs Wochen) dreimal pro Woche Proben abgenommen werden?
Der Visitenplan sieht für PatientInnen auf der Normalstation sieben Visiten sowie eine Visite bei der Entlassung vor. Bei PatientInnen der Intensivstation sind es 16 Visiten sowie eine bei der Entlassung.
2. Abnahme, Verarbeitung und Lagerung von Blut
Welche Vorgaben gibt es zu den SBS-Röhrchen?
In der Verbrauchsmaterialliste finden Sie Vorschläge zu geeigneten SBS-Röhrchen: https://www.bbmri.de/covid-19/nationales-pandemie-kohorten-netz/bioprobensammlung/
Welche Röhrchen sollen zur Blutentnahme verwendet werden?
In der Verbrauchsmaterialliste finden Sie Vorschläge zu geeigneten Blutentnahme-Röhrchen: https://www.bbmri.de/covid-19/nationales-pandemie-kohorten-netz/bioprobensammlung/
Ist für die Lagerung ein Stickstofftank notwendig?
Nach Verarbeitung der PBMC-Zellen können diese bei -80°C für maximal zwei Wochen zwischengelagert werden. Anschließend müssen Sie in der Gasphase von Flüssigstickstoff oder alternativ beispielsweise bei -150°C in der Gefriertruhe gelagert werden.
Ist für die Verarbeitung von Zellbestandteilen, Plasma und Serum eine Workbench notwendig?
Die Bioproben sind potenziell infektiös und sollten zum Eigenschutz nach Empfehlung des Ausschusses für Biologische Arbeitsstoffe (ABAS) unter einer Bench verarbeitet werden.
Ist es erforderlich, alle Plasmaarten (EDTA, Heparin, Citrat) zu sammeln, um am NAPKON-Projekt teilzunehmen?
Prinzipiell ja. Sollte dies nicht möglich sein, müsste es vorab individuell mit dem Team des NAPKON-Bioprobenkerns besprochen werden.
Sind Abweichungen bei der Plasmagewinnung zulässig (z.B. zwei Zentrifugationsschritte bei 4°C)?
Nein, der Prozess soll standardisiert ablaufen.
Ist die Überführung des Plasmas in ein Falcon mit anschließender Durchmischung vor der Aliquotierung erforderlich?
Bei der Verwendung von Pipettierrobotern ist das Aliquotieren von Serum und Plasma ohne vorherige Durchmischung möglich.
Ist es möglich, das EDTA-Vollblut ohne Zentrifugation zu aliquotieren und bis zur weiteren Aufarbeitung des Buffy Coats zwischenzulagern?
Nein, die Zentrifugation des Vollbluts muss vor der Aliquotierung durchgeführt werden. Anschließend wird nach der Plasmagewinnung die Buffy Coat-Schicht in 2 x 0,5 ml aliquotiert, damit möglichst wenig kernlose Zellen enthalten sind (s. SOP-Manual).
Ist ein Serumröhrchen mit Trenngel zulässig?
Ja, die Verwendung von Serum-Röhrchen mit Trenngel ist in Ordnung, da vergleichende Untersuchungen keine großen Unterschiede gezeigt haben.
Sind PAXgene®-Röhrchen nach Abnahme zu durchmischen?
Ja, die Röhrchen müssen nach Blutentnahme durch acht bis zehnmaliges leichtes Schwenken durchmischt werden (s. SOP-Manual).
Warum werden die PAXgene®-Röhrchen nicht aliquotiert?
PAXgene®-Röhrchen sollten komplett eingefroren und später für die Isolierung von RNA verwendet werden. In Ausnahmefällen können PAXgene®-Röhrchen aliquotiert werden - dies ist mit dem NAPKON-Bioprobenkern abzustimmen. Voraussetzung ist, dass die Aliquote vor der RNA-Isolation wieder zusammengeführt werden. Zu beachten ist weiterhin, dass dies einen Einfluss auf die Qualität der isolierten RNA haben kann. Nicht zuletzt muss die Abweichung vom SOP-Manual im DZHK-LIMS dokumentiert werden.
Ist es möglich, die PAXgene®-Röhrchen statt bei -20°C bei 4°C zwischenzulagern und dann in den -80°C-Freezer umzulagern?
Nein, da die Anleitung der Firma eine Zwischenlagerung bei -20°C vorsieht und dies an allen Standorten einheitlich umgesetzt werden soll.
Wie wird mit extrahierter RNA aus PAXgene®-Röhrchen verfahren?
Die extrahierte RNA wird zu drei Teilen aliquotiert.
Auf welche Zellzahl sollen die PBMC pro Röhrchen eingestellt werden?
Auf eine Zellkonzentration von 10x10^6 Zellen/ml pro Röhrchen; bei einem 0,5 ml Tube entsprechend 5x10^6 Zellen.
Ist es möglich, größere Volumina/Konzentrationen für die PBMC-Aliquotierung als 300 µl einzufrieren, da bei kleineren Volumina mehr Zellen absterben?
Das Volumen für die PBMC-Aliquote wurde auf 500 µl erhöht (s. SOP-Manual, verfügbar unter https://www.bbmri.de/covid-19/nationales-pandemie-kohorten-netz/?L=0).
Sind alternative Methoden zur PBMC–Isolation zulässig, z.B. die semi-automatische Methode?
Grundsätzlich ja. Bitte kontaktieren Sie das Team des Bioprobenkerns dazu in diesem Fall vorab.
Ist es möglich, die Lagerröhrchen direkt verdichtet in die Racks einzusortieren?
Nein. Für die Zuweisung der Aliquote zu den Primärprobengefäßen im DZHK-LIMS ist es notwendig, die vorgegebenen Schemata einzuhalten. Danach können die Aliquote verdichtet werden. Die Zuordnung innerhalb des FHIR-Moduls wird zukünftig auch möglich sein, dies befindet sich noch im Aufbau.
3. Abnahme und Verarbeitung von Urin
Findet eine Urinteststreifen-Untersuchung statt?
Nein, nicht im Rahmen der NAPKON-Studie – ggf. in Ihrer Klinik im Rahmen einer anderen Studie.
Wie wird das Sediment beim Urin separiert und wie kann es gelöst werden?
Der restliche Urin-Überstand wird bis auf 0,5 cm oberhalb des Sediments abpipettiert und das Sediment mit dem verbleibenden Überstand homogenisiert. Zusätzlich kann nach Dekantieren des Überstands zur Sedimententnahme der Kolben nach oben geschoben werden.
Ist es für das Überleben der Zellen nicht sinnvoll, die Zentrifugation des Urins bei 500-750 x g durchzuführen?
Theoretisch ja, aber das Ziel besteht bei der Uringewinnung nicht darin, lebensfähige Zellen zu gewinnen. Daher ist die Zentrifugationsgeschwindigkeit für Urin bei 2000 x g zulässig.
4. Abnahme und Verarbeitung von respiratorischen Proben
Welches Einfriermedium ist für BAL-Zellen geeignet?
Die BAL-Zellen müssen in einer PBS-Lösung eingefroren und bei -80°C gelagert werden. (Achtung: Die Angabe von -196°C in der Schulung vom 27. Oktober 2020 war ein Fehler und wurde korrigiert.) https://www.bbmri.de/covid-19/nationales-pandemie-kohorten-netz/bioprobensammlung/
Ist es möglich, den Rachenabstrich in PBS zu stabilisieren?
Zur Stabilisierung der Nukleinsäuren wurde DNA/RNA Shield™ ausgewählt, dies soll soweit wie möglich standardisiert durch alle Standorte umgesetzt werden.
Kann für Abstrichproben auch das Restmaterial von Routine-PCR-Tests verwendet werden?
Nein, da die Abstriche für die NAPKON-Probensammlung standardmäßig in DNA/RNA Shield™ stabilisiert werden.
Ist die Verwendung von MSwab™-Abstrichen möglich?
Nein, die Verwendung von MSwab™-Abstrichen ist nicht möglich.
Wie kann Trachealsekret aliquotiert werden, falls dieses sehr zäh ist?
In das Röhrchen, in dem bereits 6 ml DNA/RNA Shield™ vorgelegt wurde, werden 2 ml Trachealsekret pipettiert. Das Gesamtgemisch wird dadurch einfacher zu handhaben. Für eine bessere Pipettierfähigkeit des Sekrets können "wide boar" Pipettenspitzen mit größerer Öffnung verwendet werden.
Ist es notwendig, die Abstriche zu überführen, auch wenn sie direkt in den DNA/RNA Shield™ Abstrich-Röhrchen gesammelt wurden?
Nein, das ist nicht erforderlich.
Können die hochinfektiösen Bioproben (z.B. Abstriche) vor der Einlagerung inaktiviert werden?
Durch die Anwendung von DNA/RNA Shield™ werden bereits Viren inaktiviert, dadurch ist keine Virusanzucht möglich. Das Ziel besteht in der Durchführung von genetischen Untersuchungen.
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